无细胞DNA在流产调查中的应用

Emily Colley ^1,2,3,*, Adam J. Devall ^1,2, Helen Williams ^1,4 , Susan Hamilton ³, Paul Smith ^1,2, Neil V. Morgan ⁵ , Siobhan Quenby ^6,7, Arri Coomarasamy ^1,2 and Stephanie Allen ³

1. Tommy’s National Centre for Miscarriage Research, Birmingham Women’s and Children’s Hospital, Birmingham B15 2TG, UK; A.J.Devall@bham.ac.uk (A.J.D.); H.M.Williams.1@bham.ac.uk (H.W.); paul.smith@doctors.org.uk (P.S.); A.Coomarasamy@bham.ac.uk (A.C.)
2. Institute of Metabolism and Systems Research, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, UK
3. West Midlands Regional Genetics Laboratory, Birmingham Women’s and Children’s Hospital, Birmingham B15 2TG, UK; susan.hamilton15@nhs.net (S.H.); stephanie.allen13@nhs.net (S.A.)
4. Institute of Clinical Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston B15 2TT, UK
5. Institute of Cardiovascular Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, UK; N.V.Morgan@bham.ac.uk
6. Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, Coventry CV4 7HL, UK; S.Quenby@warwick.ac.uk
7. Tommy’s National Centre for Miscarriage Research, University Hospitals Coventry & Warwickshire NHS Trust, Coventry CV2 2DX, UK

* Correspondence: emily.colley1@nhs.net

Received: 1 October 2020; Accepted: 22 October 2020; Published: 26 October 2020

摘要:

大约4次怀孕中有1次流产，其中50%是由于染色体异常。连续3次流产后，推荐使用受孕产物 (POC) 组织进行遗传学检查。无细胞DNA (cfDNA) 已用于产前筛查，但在非怀孕中很少进行。我们研究了从母体血液中使用cfDNA来区分流产中的染色体异常。收集并保存了100例1期流产女性的血样2例。平均怀孕年龄为7.1周 (范围:5~11周) 。本研究未对没有POC基因检测结果的样品进行分析。

提取CfDNA并使用修改的市售全基因组无创产前检查进行分析。结果并未提供给患者。在57个样品中，通过POC分析获得细胞遗传学结果。染色体异常在POC分析的47% (27/57) 中被鉴定出来,在cfDNA分析中59% (16/27) 被准确鉴定出来。总计， 75% (43/57) 的结果被正确识别。平均cfDNA胎儿级分为6% (2-19%) 。总之，当「胎儿率」 够高时, cfDNA可用于检测流产中的染色体异常,但需要更多的研究来确定影响整体结果的变量。

关键字:

流产;无细胞DNA;细胞遗传学分析;染色体异常

1. 序章

早期流产是怀孕期间最常见的并发症 [1] ,被定义为流产。每5人中就有1人的怀孕以自然流产告终 [2] ,但其中50%是由于染色体异常所致 [3] 。确定染色体异常是否是导致流产的根本原因很重要,因为这可能影响未来怀孕的预后。如果是散发性染色体异常导致的流产,那么未来怀孕的预后比染色体补体正常的好。这种情况下，流产的原因可能是染色体以外的原因。如果染色体重组不平衡,父母中的一方可能具有平衡的染色体重组。这意味着未来的怀孕可能受到相同或其他不平衡染色体重排的影响。在这种情况下，采集血样进行父母的核型检查以评估复发的风险是很重要的。

第三次流产后的怀孕组织的细胞遗传学分析,或者如果没有怀孕组织, Royal College of Obstetricians and Gynaecologists (RCOG) Green-topGuideline No.17 [4] 建议对父母样本进行核型分析。以往，在检测怀孕组织的异常时,使用细胞培养和G带染色体分析。然而，由于接收的组织的质量较差,难以从这些组织中培养细胞,并且检测微缺失综合症和重复综合症的分辨率有限,因此失败率通常很高。因此，已经在实验室之外实施了基于分子的方法，例如定量荧光PCR (QF-PCR) 和微阵列。

目前，用于流产的基因检查是使用由胎盘成分和胎儿成分组成的怀孕组织 (被称作受孕产物 (POC) ) 进行的。这些组织必须保持新鲜、无污染和无固定状态,才能识别胎儿组织并进行DNA提取和细胞培养。这涉及母体细胞污染 (MCC) 的风险，其可能导致样品的误认。POC样本包含与胎儿组织相关的母体组织。在DNA提取过程中，母体细胞可能在胎儿组织的选择过程中转移，导致母体DNA,或者母体细胞在细胞培养过程中过度增殖。此外，在许多情况下， POC是不可用的或不会被患者退回。

无细胞DNA (cfDNA) 最初由Dennis Lo [5] 鉴定出来,证明孕妇血浆中的部分cfDNA代表胎儿的整个基因组。尽管cfDNA已被用于产前筛查，但迄今对未怀孕妇女的研究还很少。只有Clark-Ganheart等人和Yaron等人的两项研究 [6,7] 评估了cfDNA在流产情况下的使用情况。

前瞻队列研究Clark-Ganheart等 [6] 分析了50例非受孕的cfDNA样本。根据超声波检查，怀孕年龄是从6.1周到38.4周之间的范围。在这些样本中，对50个样本中的38个样本进行了可报告的结果,其中8个样本确认了染色体三体综合症。在Yaron等人的研究 [7] 中，为了分析14周以下的流产,检查了cfDNA。在总共86例怀孕中,获得了具有等同POC的cfDNA结果 (来自CVS取样) 。胎儿部分的中间值为5%。在86个样本中，有55个样本 (64%) 存在染色体异常，其中30个样本 (55%) 使用标准的无创产前检查 (NIPT) 对数似然比 (LLR) 截断法进行了检测。为了提高灵敏度，使用了50个样本的「训练集」 开发了特定于流产的阈值。这将检测率提高到82%。

在通过简单的血液检查来诊断流产时, CfDNA对于确定流产的染色体原因非常有用。本研究探讨了如何利用cfDNA检测流产中染色体异常，并将其结果与POC检查结果进行比较。

2. Materials and Methods

2.1. 伦理认可

该研究由Tommy’sNational Centre for Miscarriage Research进行，并获得了IRAS项目ID 215646的研究道德认可(REC参考16/WM/0423, 23/11/2016, West Midlands-South Birmingham研究道德委员会)和健康研究机构 (HRA) 的批准。

2.2. 患者样本

有过早期流产经历的患者，在伯明翰妇女和儿童医院举办的Tommy’sNational Centre for Miscarriage Research中取得了患者的知情和同意。

2017年2月至2019年7月， NHS信托和University Hospital Coventry&Warwickshire NHS信托明确同意使用患者的POC和遗传物质。收集样本作为医学研究的贡献,并根据人类组织法 (HTA) 处理组织。提供者保留撤回同意以供进一步使用的能力，但不保留取得样本后的权利。

资格标准包括16岁以上的母亲的年龄，以及在诊断流产时通过超声波检查确认的怀孕时间小于12周的怀孕组织保留在原来的位置。当通过相应的POC分析获得细胞遗传学结果时，样本被包括在分析中,但排除了7个已知的三倍体病例。

采集血液样本用于cfDNA分析和βhCG级别的评估。用无细胞DNA BCT (STRECK) 管收集最多10 mL母体血液用于cfDNA,并在可能的情况下用超声波测量冠-臀长度 (CRL) 以评估胚胎怀孕。通过POC测试获得的染色体异常通过标准患者护理传达给患者。CfDNA结果未与患者共享。

2.3. 样本的处理

用双重离心法从全部血液中分离出血浆,用1mL的等份转移到DNA LoBind管 (Ependorff) 中。这些等分试样保存在-80°C直至使用。

2.4.  细胞遗传学分析

对于3次及以后连续流产后的POC,按照RCOGGreen-top指南No.17 [4] 抽取受孕产物 (POC) 作为常规临床标本,并进行靶向QF-PCR和染色体微阵列分析 (CMA) 。

首先对POC的DNA进行QF-PCR染色体三体筛选,染色体三体13、18或21,三倍体,性染色体非整倍性。在QF-PCR中报告有异常。正常情况下，采用OGT CytoSure 8×60 k Constitutional v3设计，外显子/基因水平分辨率为~500 DDD/ClinGen策定的发育基因和综合症区,分层主干分辨率为~120~500 kb, CytoSure v4.9和CBS算法构建GRCH37进行分析,进行CMA检查。在微阵列分析中，检测到超过1Mb的复制数的不平衡,并且在某些情况下获得更高的分辨率。

2.5. 无细胞DNA检验

将来自同意由外部测试机构进行测试的患者的血浆 (1 mL) 提交给剑桥的Illumina实验室，并使用如前所述修改的Illumina VeriSeqTM NIPT解决方案v 2工作流程以24个样品批次处理 [8, 9] 使用最新的分析平台 [10] 进行了一些小的修改。

3. 结果

在确认流产后，共收集了102个cfDNA样本。通过在NextSeq 500上进行VeriSeqTM NIPTv2Solution分析来分析所有102个样本。我们收到了85个相对应的POC样本。共有64例怀孕的POC分析获得了相应的细胞遗传学结果,21例POC样本不适合分析,17例cfDNA样本未收到相对应的POC样本。从cfDNA分析中排除了17个未接受的POC样本和21个不适合分析的POC样本，并排除了已知的三倍体怀孕 (图1) 。

通过POC分析在27/57个病例 (47%) 中证实了染色体异常。患者基本特征总结在表1中。进行相应细胞遗传学分析57例，平均年龄34岁 (20~43岁) ，临床怀孕7.1周 (5~11周) ,胎儿率6% (2~19%) 。使用VeriSeqTM,所有含有16/27 (59%) 遗传异常和27/30 (90%) 遗传正常的样本的70% (40/57) 都被成功地鉴定。

这相当于灵敏度59% (16/27) ，特异性90% (27/30) ，准确度75% (43/57) ，尽管样本队列相对较小。

表1.cfDNA样本的特征 (三倍体怀孕除外) ,获得适合分析的相应受孕产物 (POC) 的结

	总计 (n = 57)	染色体正常 (n = 30)	染色体异常 (n = 27)
母亲年龄 (年) (平均值和范围)	34 (20-43)	31 (20-41)	37 (24-43)
过去的损失 (平均值和范围)	3.8 (0-14)	4.1 (0-14)	3.3 (0-6)
怀孕年龄 (周) (平均值和范围)	7.1 (5-11)	7.4 (5-11)	6.4 (5-9.3)
βhCG (mIU/mL) (平均值和范围)	38,356 (69-263,766)	50,632 (69-263,766)	21,538 (491-100,638)
胎儿百分比(%) (平均值和范围)	6 (2-19)	7 (2-19)	5 (3-12)

CfDNA分析中，准确鉴定了43/57例 (75%) ,其中异常16例,正常27例。表2比较了通过POC检测出异常的病例的POC结果和cfDNA检查结果。用POC检测到的异常为:普通染色体三体 (3) 、与单体X (2) 、45、X复合的普通染色体三体 (1) 、单体21 (1) 、完全矮型染色体三体 (14) 、镶嵌型矮型染色体 (2) 、复制数变异 (4) 。在罕见的染色体三体中，染色体三体22和染色体三体15最常见。胎儿分数为3~12% (平均5%) 。在40/57个样本中, CfDNA的结果与POC的结果完全一致。CfDNA结果27/30例产生正常结果,已知正常病例的3/30例产生不同结果。在cfDNA测试中2个镶嵌样本 (样本ID 51和586) 未被正确识别,但在这些样本中检测到其他不平衡。在样本ID 228中, POC获得了单体21的结果,但在cfDNA测试中,在其他几条染色体上鉴定了CNV。

4个样本流产, POC分析显示染色体以下缺失和重复 (样本ID 133、202、303、319) 。通过cfDNA分析检测到7q 22.1q 36.3的56 Mb重复和19q 13.12q 13.43的21Mb末端重复。在cfDNA分析中未检测到13q 13.3q 34中70Mb的缺失， 7q 36.2q 36.3中6 Mb的末端缺失， 4q 34.3q 35.2中9Mb的末端重叠， 5q 33.1q 35.3中30Mb的末端缺失。

为了观察cfDNA分析和POC细胞遗传学分析之间的结果调用是否可以改善，使用不同的怀孕,βhCG值和胎儿级分截止分为三类 (表3) 。怀孕期间分为4组,未满7周,7~8周,8周以上和未知怀孕。在这些组中，通过cfDNA测试准确鉴定的染色体异常随着怀孕时间的延长而增加。βhCG值分为小于8000、8000~35000、35000 mIU/mL以上3组。当这些组的βhCG水平增加时，通过cfDNA测试正确识别的染色体异常也增加。胎儿分级组分为3组。将其分为小于5、5~8和9以上3组。在这里,随着胎儿分级组的增加, cfDNA检测染色体异常的正确率也随之增加。

Table 3. POC的CfDNA对核型

		CfDNA的结果
		正常识别 (%)	无法识别 (%)
	总计	43 (75.4)	14 (324.6)
怀孕期间 (周)	不满7周	14 (66.7)	7 (33.3)
	7～8周	10 (76.9)	3 (23.1)
	8以上	11 (100.0)	0 (0.0)
	未知	8 (53.3)	7 (46.7)
βhCG (mIU/mL)	不满8000	9 (60.0)	6 (40.0)
	8000～35,000	14 (66.7)	7 (33.3)
	35,000以上	19 (95.0)	1 (5.0)
胎儿百分比(%)	不满5	13 (59.1)	9 (40.9)
	5～8	19 (79.2)	5 (20.8)
	9以上	10 (100.0)	0 (0.0)

4. 讨论

我们的cfDNA研究队列是通过伯明翰妇女医院和大学医院考文垂和沃里克郡的Tommy’sNational Center for Miscarriage Research招募的。使用修饰的VeriSeqTM NIPT V 2 (Illumina) 评估总共102个样品，并通过相应的POC细胞遗传学分析分析57个样品。

cfDNA分析分为三类 (表3) 。在胎分率低的情况下,低于5%的胎分率只有60%的样本证实染色体异常,其中大多数是异卵怀孕。另一方面，如果胎儿率为9%或更高，则100%的细胞遗传学结果被正确识别。在我们的研究中，我们注意到如果胎儿率超过5%，则可以检测到大多数异常。然而，由于样本数量少，且存在生物变化,因此很难定义准确的截断点。

POC基因检测结果与cfDNA检测结果之间的差异可能由胎盘嵌合体引起。CfDNA分析仅检测来自胎盘/细胞母细胞的DNA,而POC检查可能包含胎儿组织和整个胎盘组织。这可能导致结果不一致。在两种情况下，通过POC分析鉴定了无法通过cfDNA检测鉴定的嵌合体基因异常。这些结果可能是由于胎盘嵌合体局限于腺体细胞,也可能是由于目前方法的局限性。镶嵌体很难通过任何方法进行诊断,并且cfDNA分析可能在目前的POC检测中起到辅助作用,以检测与生物学相关的异常细胞系。

托米的流产研究国家中心专门照顾反复流产的家庭。这些家庭非常了解自己何时怀孕,并通过在第一次怀孕期间密切监测来获益。因此，我们研究小组的流产诊断比其他研究更早。Clark-Ganheart等人 [6] 记录了16.9周 (6.1 -37.2) ， Yaron等人 [7] 记录了9.6周 (5.1 -13.6) (图2) 。

这项研究和其他研究表明，在大多数怀孕组织仍在原位的失孕病例中,可以使用cfDNA检测染色体异常。在这项研究中， 59%的染色体异常被准确识别,与POC结果的符合率为75%。对此，Clark-Ganheart等 [6] 在有可利用的细胞遗传学结果的情况下，显示了87.5%的一致率， Yaron等 [7] 在使用怀孕损失特异性的LLR阈值的情况下,显示了82%的匹配率。Yaron等 [7] 使用50例作为训练组,设定怀孕损失特异性LLR阈值。非嵌合体病例86例,总体检出率为82%。这是在基于训练组识别怀孕损失特异性LLR之后实现的。该事实表明,该队列所需的LLR必须不同于单胎怀孕。为了进行比较，本研究使用标准的NIPT LLR截断法分析cfDNA,具有怀孕损失特异性的LLR可能会提高检出率。该研究的下一步是使用与Yaron等人 [7] 提出的算法相同的算法，使用修改过的LLR进行管道测试，以优化该队列中所有常染色体三体性的检出率。

本研究和其他研究 [6,7] 表明， cfDNA可用于评估流产的遗传贡献。然而，仍有一些遗传异常可能会被遗漏，这取决于所用的检测方法 (例如,三倍体或嵌合体样本,低胎儿率/低妊娠期常染色体三体) 。三倍体的病例，由于修正后的Illumina VeriSeqTM NIPT solutionv2工作流无法检测出来,因此在本研究和Yaron等人 [7] 中都被排除。然而，基于单核苷酸多态性的cfDNA分析平台应该能够鉴定三倍体病例。

cfDNA不能完全取代目前的细胞遗传学检查。Yaron等人 [7] 提出了一种复发性怀孕损失算法,利用cfDNA检测复发性怀孕损失。

如果诊断为第三次或第三次流产,根据皇家高等医学科学院 (RCOG) 绿色顶部指南第17号 [4] 的现行指南,应检查怀孕组织中是否存在胎儿非整倍体。在此常规检查的同时，可采集母亲的血样以完成cfDNA检测。如果cfDNA检测到异数并解释了流产的原因，则不需要进一步的操作，因为数字误差通常是零星发生的,后续成功怀孕的可能性不会受到负面影响。由于cfDNA只检测不平衡的染色体异常，如果cfDNA未检测到染色体异常，应进行POC的细胞遗传学分析，以确定是否存在cfDNA检测不到的染色体异常(CNV、三倍体、嵌合体样品等) 。这可以减少所需POC测试的数量，并可能为许多无法使用POC的患者提供结果。即使POC不可用，也要注意忽略某些染色体异常。如果发现不平衡易位，应推荐父母进行核型检查,以评估父母中的一方 (或双方) 是否是该易位的携带者。

5. 结论

了解怀孕损失的遗传结果可以用于咨询患者以了解未来怀孕的预后。也可以帮助人们摆脱失孕的罪恶感,提供心理上的支援。

使用cfDNA来确定流产的原因是否是由于染色体异常导致的，这将对无法进行测试的怀孕组织或不能进行常规细胞遗传学测试的患者产生重大的临床影响。但是，只有在诊断流产时仍然怀孕的情况下,才能进行cfDNA检查。

当怀孕组织仍在原位时,就采集母体血浆样本,并证明在某些情况下,如果胎儿部分充足, cfDNA可用于检测流产的遗传异常。需要进一步的工作来改进该测试，并确定可能影响总体结果的变量，以便其可用于临床。

作者的贡献

E.C.–数据分析和写作;A.J.D.-研究设计和伦理认可;H.W.–研究设计、道德认可、资助管理和编辑;S.H.–数据分析和关键评估;P.S.-研究设计和批评评价;N.V.M.-监督和批判性评价;S.Q.–批判性评估;A.C.-研究设计、监督和批判评价;S.A.-研究设计，监督，批判性评估，数据分析，写作和编辑。所有作者阅读手稿并同意发布版本的手稿。

提供资金

这项研究由托米的慈善机构资助,该机构向托米的国家流产研究中心提供资金。

感谢

作者感谢LievePage-Christians, Philippa Burns, Patrizia Di Pietro, Cosmin Deciu, Sarah Kinnings, Eoin Brown, Victoria Corey, Kathryn Robinson, Sven Schaffer, Sucheta Bhatt, Barbara Baggiany, Matt Smith, Marion Burdin, Jasmin Dehnhardt。作者感谢伯明翰妇女儿童医院托米国家流产研究中心和大学医院考文垂与沃里克郡的研究团队招募患者并收集样本。

利益冲突

作者没有宣布利益冲突。

参考文献

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出版者注释

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